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免疫螢光染色(IF) 實驗—如何直達完美多重染色？

免疫螢光染色(IF) 實驗—如何直達完美多重染色？

 直接vs間接螢光染色 

免疫螢光 (Immunofluorescence, 以下簡稱IF) 是生物學中一種常用工具，主要通過使用抗體來可視化蛋白質的表達、分佈和位置轉換，並利用顯微鏡進行觀察。常規免疫螢光是將螢光染料與二抗偶聯，利用二抗來辨識一抗並與之結合 (間接 IF)，通常用於檢測細胞或組織中的單一抗原。

多重染色是在同一組織樣本中同時檢測多種抗原的方式，這些實驗揭示了同時探索細胞和組織微環境中各種分子之相互作用以獲得信息的重要性。直接 IF 染色是螢光團直接與一抗結合以檢測感興趣的抗原。直接偶聯螢光染劑的抗體由於在同一樣品中可以染多個抗原的簡便性和靈活性以及在多重染色時提供的多種優勢而越來越受歡迎。

▲直接vs間接螢光染色

Proteintech 一系列直接偶聯 CoraLite® 的抗體為您提供完美的免疫螢光染色實驗，具有非常多種優勢，讓我們一一告訴你。

1. 節省時間

間接 IF 多重染色通常需要很長時間，因為多個一抗和二抗需要照順序incubate而不能同時加入，並常常伴隨著好幾次的洗滌步驟，這都使得實驗時間更長。但是直接偶聯螢光團的一抗，例如我們的 CoraLite® 抗體，能夠同時incubate不同的一抗，從而減少實驗步驟，並且不需要加入二抗，進而減少相關inbubate時間及洗滌步驟，為您節省大量時間。

▲使用 Coralite 偶聯一抗對小鼠心臟和小鼠腦組織進行多重免疫螢光染色

2. 避免物種交叉反應​​

             1)不同物種中相似序列造成誤認

來自不同物種的免疫球蛋白若具有保守序列和相似的四級結構。針對同一個物種所產生的二抗很可能通過這些相似結構與樣本中的內源性免疫球蛋白或來自不同物種的一抗結合，導致高背景或假陽性結果。因此，Cross-adsorbed secondary被提出以克服這些缺點，但這可能會減少二抗的靈敏度。 使用具備高度特異性和靈敏性的螢光染料偶聯一抗進行多重檢測，無需二抗介入，從而避免了這些問題。

             2)樣品及抗體物種相同問題！

成功的多重染色實驗往往需要縝密的規劃，從抗體的選擇、螢光團激發/發射光譜的兼容性到顯微鏡配置等。最關鍵的一步是選擇具有正確特異性和靈敏度的抗體。一般多重染色實驗中使用的一抗必須選擇不同的物種或不同亞型(subclass)。另外，在組織上使用二抗時，內源性抗體會被封閉以避免高背景產生，而當使用與樣品相同的物種產生的一抗時 (例如在小鼠組織上使用抗小鼠二抗)，這個問題便會更加明顯。

因此，螢光染劑偶聯一抗可以為您簡化實驗步驟，因為它允許使用在同一物種、同一樣本中產生的多種抗體，而無需擔心樣本物種或抗體同種型。它還允許使用與樣品在同一宿主中產生的抗體，而無需任何額外的封閉步驟。

Coralite偶聯抗體進行多重螢光染色之範例

Proteintech 提供超過一千種經免疫螢光(IF)驗證的 Coralite 偶聯一抗。 Coralite 螢光染料具有卓越的亮度、高光穩定性和窄發射光譜，使其成為多重螢光染色實驗的絕佳選擇。

▲圖中分別為相同抗體偶聯三種不同的Coralite。 a-c) 與Coralite488, 594 和647 偶聯的BOULE 抗體。d-f) 與Coralite488, 594 和647 偶聯的DAZL 抗體。g-i) 與Coralite488, 555 和647 偶聯的TNP1 抗體。在小鼠睾丸組織上進行實驗。

我們精心挑選經過文獻高度引用的一抗，來做為Coralite偶聯的抗體。這些抗體提供了兩到三種顏色，Coralite488、Coralite594 和 Coralite647，為多重免疫螢光實驗的設計提供了更大的靈活性。我們使用經過良好控制的Coralite偶聯方案產生之具有最高批次穩定性的偶聯抗體。並使用直接偶聯Coralite的抗體通過創造低背景、高分辨率圖像來提升您的IF實驗結果，同時藉由消除交叉反應來減少您的實驗流程，進而為您節省時間。

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