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磷酸化樣本檢測不到？可能你的樣本需要來點刺激的！

磷酸化樣本檢測不到？可能你的樣本需要來點刺激的！

近幾年，Proteintech 一直致力於拓寬新的產品線，其中之一就是磷酸化抗體。截至目前的磷酸化抗體數量已經有幾百種，包含兔多抗 (Rabbit polyclonal antibody)、鼠單抗 (Mouse monoclonal antibody)、兔重組單抗 (Rabbit recombinant antibody)。

在磷酸化抗體研發的過程中，我們發現選擇合適的刺激條件，是磷酸化蛋白檢測中至關重要的一步。

今天就來為大家說明，在磷酸化蛋白檢測中，有哪些常用的刺激方法吧~

主要包括：缺氧誘導 (Hypoxia stress), DNA損傷誘導 (DNA damage), AMPK 活化 (AMP-activated protein kinase activation), PKC活化 (Protein kinase C activation)，磷酸酶抑制 (Phosphatase inhibitor), mTOR抑制 (Mammalian target of rapamycin inhibition) 以及PI3K抑制 (Phosphoinositide 3-kinase inhibition) 等。

1. Cobalt Chloride 刺激模擬缺氧環境

缺氧環境下，許多蛋白磷酸化的程度會有明顯變化，而氯化鈷（cobalt chloride，CoCl₂）可用於模擬細胞缺氧環境。

一方面 Co²⁺ 通過直接取代類血紅素中的 Fe²⁺ 使血紅素不能與 O₂ 結合而維持缺氧狀態；另一方面，Co²⁺ 會置換 prolyl hydroxylase 以及 aspartic acid hydroxylase 催化基團上的 Fe²⁺，進而抑制缺氧誘導因子（Hypoxia-inducible factor 1, HIF-1）的降解，活化了 HIF-1 signaling pathway。

Tips：處理細胞過程使用缺氧培養箱，通過調控 N₂、Co₂、O₂ 的比例來達成低氧或缺氧環境。需要注意的是，Co​Cl₂ 處理無法完全達成缺氧條件 (Fig. 1，參考文獻 1)。

▲Fig. 1 在CoCl₂處理和正常缺氧環境下，STAT3的磷酸化表現量顯示出不一致的趨勢。

2. Etoposide、MMS 誘導 DNA 損傷

Etoposide是TOP Ⅱ (Topoisomerase Ⅱ) 的抑制劑。Etoposide 能與 TOP Ⅱ 及 DNA 形成複合物，導致 DNA 無法修復而造成 DNA 損傷。

ATM（ataxia telangiectasia-mutated）Ser1981 位點會發生自磷酸化 (Autophosphorylation)，參與 DNA 損傷過程。CHEK2 (Checkpoint kinase 2) 作為 ATM 受質，使 Thr68 位點被磷酸化並活化，進而磷酸化下游 p53 的 Ser15 位點，這一系列過程使細胞停滯在 G2/M 時期。此外，Etoposide 也對癌細胞具有殺傷作用，成為抗腫瘤藥物。類似造成 DNA 損傷的還有 MMS (Methyl methanesulfonate)，一種烷基化劑 (Alkylating agents)，也是一種潛在的致癌物 (Fig. 2)。

▲Fig. 2  Etoposide 誘導 HT-29 細胞 P53(Ser15) 磷酸化和 MMS 誘導 PC-3 細胞 CHEK2(Thr68) 磷酸化。

3. AICAR 啟動 AMPK 訊息傳遞

AICAR (AICA ribonucleotide) 是 AMP 的類似物。AICAR 由腺苷轉運蛋白 (Adenosine transport protein) 轉入細胞後，被 adenosine kinase 磷酸化後形成 ZMP (AICAR monophosphate)。ZMP 可類比 AMP 對 AMPK 及 AMPKK 的活化，而高濃度的 AICAR 會促進細胞凋亡 (參考文獻 2)。

4. Forskolin 啟動 cAMP 信號

Forskolin（Coleonol）是從毛喉鞘蕊花 (Coleus barbatus) 分離的二萜類化合物 (Diterpene) 屬於脂溶性化合物，能穿透細胞膜刺激 adenylate cyclase 將ATP 轉變成 cAMP，進一步導致多種蛋白的磷酸化水平發生改變。例如 Forskolin 處理細胞增加了 CREB（cAMP-response element binding protein）的磷酸化 (Fig. 4)。

▲Fig. 4  Forskolin 誘導 HSC-T6 細胞 CREB1(Ser133) 磷酸化。

5. PMA 啟動 PKC pathway

PMA 別名 TPA，廣泛用於 in vivo/in vitro 實驗，PMA 可以結合且活化 PKC，也能促進 CREB 磷酸化。

另外 PMA 還會誘導 THP-1 細胞分化為巨噬細胞。

6. BMP-2/Smads signaling 啟動

BMP-2 (Bone morphogenetic protein 2) 是成骨作用 (Osteogenesis) 和誘導成骨細胞分化 (osteoblast differentiation) 的胞外訊號關鍵分子之一。BMP-2 有兩種受體（BMPRs），均具有 serine/threonine kinases 活性，可直接作用並磷酸化下游的 Smads 蛋白，磷酸化的 Smads 從細胞質轉移到細胞核，調控基因轉錄 (Fig. 5，參考文獻 3)。

▲Fig. 5 BMP2 誘導皮質神經元和 HepG2 細胞 SMAD1 磷酸化。

7. Staurosporine 抑制蛋白激酶（Protein kinase）活性

星形孢菌素（Staurosporine）是從細菌 (Streptomyces staurosporeus) 分離出的天然生物鹼 (alkaloid)，屬於 ATP 競爭型蛋白激酶抑制劑，可抑制 PKC、PKA 等活性。

用 Staurosporine 處理 SH-SY5Y 細胞，能通過 Caspase-dependent and -independent pathway 引起細胞死亡；在細胞週期檢測中，0.5nM Staurosporines 能有效使細胞阻滯在 G2/M 週期。

8. Nocodazole 抑制微管聚合

Nocodazole 是一種能使微管聚合 (Microtubules polymerization) 的可逆抑制劑，實驗室常使用 Nocodazole 調控細胞停滯在 G2/M 週期或誘導細胞凋亡。細胞在同步到有絲分裂時 ASK1 被啟動。ASK1 又分別通過 MKK3/MKK6和MKK4/MKK7 的磷酸化啟動 p38 和 JNK (Fig. 6，參考文獻 4)。

▲Fig. 6 Nocodazole 增強 MCF-7 及 HEK 293 細胞 ASK1/MAPK signaling 的活化。

9. Rapamycin 抑制 mTOR signaling

Rapamycin 是一種 mTOR 抑制劑，能與 FKBP12 結合形成複合物並成為 mTORC1 的變構抑制劑 (Allosteric inhibitor) (Fig. 7)。

▲Fig. 7 Rapamycin 抑制 HEK-293 細胞 mTOR (Ser2448) 磷酸化。

10. LY294002/Wortmannin 抑制 PI3K/AKT pathway

LY294002 是由人工合成含有 morpholine 化合物的強效蛋白質抑製劑，其中也能夠抑制 PI3K 活性並影響 PI3K/AKT pathway，包含 AKT 的磷酸化。另外，Wortmannin 與LY294002 功能類似，也是一種有效的 PI3K 抑制劑。

11. Calyculin A 與 Okadaic Acid 抑制磷酸酶

Calyculin A (Cal A) 是從海綿 (Disodermia calyx) 分離得到的一種海洋毒素 (marine toxin)，是 PP1（protein phosphatase 1）和 PP2A（protein phosphatase 2A）的抑制劑，但對酸性磷酸酶 (ACP) 或鹼性磷酸酶 (ALP) 及磷酸-酪氨酸蛋白磷酸酶 (PTPases) 等無抑制作用。

Okadaic Acid (OA) 也是一種磷酸酶 (PPs) 抑制劑，但與 Calyculin A 不同的是，對於 PP1 的抑制性較弱 (Fig. 8，參考文獻 5)。

▲Fig. 8 用 10nM Calyculin A 處理 MCF-7 細胞 2 小時，能抑制超過 50% 的 PP1 和 PP2A 活性；

但用1μM Okadaic Acid 處理 MCF-7 才能達到 10nM Calyculin A 處理的效果。

嗯哼~

以上就是今天分享的幾種刺激實驗樣本磷酸化的方法

有需要的大家可以收藏啦~

咳咳~ 既然都講到磷酸化了，那就不得不提一個問題啦~

除了適當的刺激之外，做磷酸化蛋白的檢測，大家還需要注意另一個問題：

蛋白的磷酸化是一個非常迅速的過程，在樣本準備過程中，當細胞被裂解會有各種蛋白激酶和磷酸酶的釋放而干擾待測蛋白的磷酸化狀態。

因此，在製備樣本過程中需要加入蛋白酶抑製劑及磷酸酶抑製劑，抑制二者的活性。

這裡倍思特代理的 Abbkine 及 AbMole 也對此開發了一套效果非常棒的輔助試劑，有需要的大家可以放心嘗試哈!

當然啦，別忘了還有 Proteintech 的磷酸化抗體，都是按照最嚴格的品質標準測試後上線

後續陸續還會上線更多的新品，敬請期待！

以上僅展示部分產品

【參考文獻】

1. Hwang, Soohyun et al. Phosphorylation of STAT3 and ERBB2 mediates hypoxia-induced VEGF release in ARPE-19 cells. Molecular medicine reports vol. 22,4 (2020): 2733-2740. doi:10.3892/mmr.2020.11344

2. Anilkumar, Ujval et al. AMP-activated protein kinase(AMPK)-induced preconditioning in primary cortical neurons involves activation of MCL-1. Journal of neurochemistry vol. 124,5 (2013): 721-34. doi:10.1111/jnc.12108

3. Sun, Qi et al. Role of miR-17 family in the negative feedback loop of bone morphogenetic protein signaling in neuron. PloS one vol. 8,12 e83067. 11 Dec. 2013, doi:10.1371/journal.pone.0083067

4. Cho, YC et al. Cell cycle-dependent Cdc25C phosphatase determines cell survival by regulating apoptosis signal-regulating kinase 1. Cell death and differentiation vol. 22,10 (2015): 1605-17. doi:10.1038/cdd.2015.2

5. Gu, Jianlan et al. Protein Phosphatase 1 dephosphorylates TDP-43 and suppresses its function in tau exon 10 inclusion. FEBS letters vol. 592,3 (2018): 402-410. doi:10.1002/1873-3468.12976

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