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【Twist Bioscience】多重基因片段文庫(Multiplexed Gene Fragments)：改善高通量篩選的關鍵

【Twist Bioscience】

多重基因片段文庫(Multiplexed Gene Fragments)

改善高通量篩選的關鍵

在本文中將帶您了解多重基因片段文庫(Multiplexed Gene Fragments)如何

1. 簡化您的工作流程，避免拼接造成的序列偏差
2. 完整利用AI/ML在抗體開發中的力量
3. 擴大您的篩選範圍，並保有高度準確度和產量均一性

當實驗只是一個想法時，其實際操作的限制往往會被可能發現的誘人的結果所掩蓋。人們很難理解實驗室工作中的不完美現實是如何累積起來的，有時多幾個樣本、多幾個變數或多一兩個步驟似乎也很合理。但在真正開始使用pipette加樣和進行實驗時，真相才變得清晰：更少的工作，通常才是取得更多成就的最佳途徑。

這一點在高通量篩選中尤其明顯，研究人員通常必須經歷繁冗的過程，將短片段的寡核苷酸組裝成長片段的雙股DNA（dsDNA）。從概念上講，這個過程非常簡單：合成數千條至數十萬條寡核苷酸，將其轉化成dsDNA形式，克隆到載體中，然後將其遞送到目標細胞中進行表達和下游篩選。這是許多高通量應用的基礎，從大規模平行報告基因分析（MPRA）到大規模抗體開發計畫。儘管高通量篩選的概念很簡單，但實際運用上卻並非如此。

在這些計畫中，研究人員面臨的一個微妙而又重要的障礙是需要合成混合的DNA片段。 dsDNA的單一片段可透過常規方法構建，但這些技術不容易擴展。在需要數千個不同的dsDNA片段時，例如高通量篩選中，研究人員必須依賴嚴重受限的混合dsDNA合成過程。

"Twist Bioscience 多重基因片段文庫

助力您以更少的工作

獲得更多的回報"

一直以來，為了可靠地生產大量的混合DNA片段，製造商必須將片段的長度縮減到150至300 bp。這意味著，在大多數應用中，研究人員必須將多個DNA片段拼接在一起才能形成所需的序列，無論是基因、抗體可變區，還是串聯 guide RNA。這種做法增加了複雜性和資源限制，會削弱篩選專案的規模、效率和影響力。

簡單地說，創建混合的合成DNA片段有其局限性，這使得研究人員在實驗準備過程中做了更多的工作，卻得不到理想的回報。這正是Twist多重基因片段文庫(Multiplexed Gene Fragments)發揮作用的地方。有了多重基因片段文庫，Twist如今可提供混合形式的長度為301至500 bp的客製化雙股DNA片段，這些片段採用直接合成法生產，實際上具有無限的擴展潛力。透過提高多重dsDNA合成的長度和規模，多重基因片段文庫帶領該領域向前邁出了重要的一步。

 突破DNA合成的界限 

多重基因片段文庫的額外優勢為研究人員開啟了全新且重要的可能性。最令人興奮的應用之一是抗體的發現和開發。抗體具有與特定抗原結合的獨特能力，在治療和診斷應用中都至關重要。抗體工程的一個重點領域是對互補決定區（CDR）進行優化，其中胺基酸序列的微小變化可顯著改變表位結合動力學。

 AI/ML在抗體開發中的力量 

人工智慧（AI）和機器學習（ML）已經徹底改變了多個科學領域，抗體開發也不例外。透過分析龐大的資料集，這些技術可以鑑定結合模式，並預測哪些抗體序列最有可能成功。傳統的抗體庫通常包含數百萬個變體，而AI/ML引導的抗體庫則小得多。這些更聰明的抗體庫可能只包含數千個變體，而每個變體都是根據其潛在效力精心挑選的。

傳統的抗體發現和優化需要建立龐大的變體庫才能進行大規模篩選。為了實現這一點，需要合成並連接各種組合的DNA短片段來組裝文庫。這種方法雖然有效，但卻存在一定程度的隨機性，無法完全控制變異的種類和數量。

在抗體優化過程中，研究人員已經確定了候選抗體，並希望透過合理地改變CDR序列來改良候選抗體的性質，此時的缺乏控制特別具有破壞性。借助人工智慧（AI）和機器學習（ML）軟體，這些文庫的設計越來越精細，研究人員可以將篩選範圍縮小到集中的候選片段池中。然而，在採用傳統方法合成文庫時，創建一個範圍較小的片段池是一項具有挑戰性的任務，而且還面臨變體代表性不足的風險。

幸運的是，抗體可變區（CDR所在的區域）的長度約為400-450 bp。透過直接合成長達500 bp的片段，多重基因片段文庫讓研究人員能夠在單一片段中編碼整個抗體可變區，包括全部三個CDR。這種控制水平讓人們能夠高度精確地設計和合成抗體變體庫。 Twist多重基因片段文庫實現了每個訂購序列的全面代表性，確保精確控制變異構建，進而實現更有靶向性的合理篩選（圖1）。此外，透過對CDR序列的高解析度控制，研究人員可以縮小篩選池的規模，以匹配AI/ML設計，最終大大提高篩選的效率和生產力。

 擴大篩選範圍 

多重基因片段文庫的優點不僅限於抗體開發。利用大規模平行報告基因分析進行mRNA篩選的研究人員也能從中獲益。 mRNA篩選通常需要研究非編碼調控元件，例如可能影響mRNA動態的非轉譯區（UTR）。重要的是，UTR的長度往往超過200 bp。有了多重基因片段文庫，合成這些DNA篩選池就變得很簡單，這便於對分析設計進行更多控制，並像抗體優化一樣實現高效研究。

▲ 圖一、500 bp Multiplexed Gene Fragments 中每個映射雙 gRNA 變異體（X 軸）的讀數圖。

此外，多重基因片段文庫也為CRISPR技術領域開啟了新的大門。

CRISPR是一種強大的基因編輯工具，它依賴guide RNA來導引Cas酶靶向特定的DNA或RNA序列。近年來，對更長DNA片段的需求正穩定成長1。研究人員可能希望在單一表達框中編碼多個guide RNA，每個 guide RNA靶向相同的基因，以提高基因敲除的效果。或者，使用多條 guide RNA 來同時擾動不同的基因，以揭示潛在的上位關係和合成致死組合2。還有一些人對CRISPR技術的更高級應用感興趣，他們進行PRIME編輯，用合成設計的DNA序列（往往很長）來取代內源性序列組合3,4。

在每個應用場景中，CRISPR表現框（攜帶 guide RNA、模板DNA、報告基因及其他元件）的精確合成都至關重要。即使是單一鹼基錯誤也會降低基因組編輯的成功率，並帶來錯誤結論。多重基因片段文庫能夠產生混合形式的長片段DNA，同時保持高的準確度和均一性（圖1），這樣單一500 bp片段中就能包含多條guide RNA（4-6條）。因此，它增加了高階CRISPR篩選應用的精確度和潛能，從多嚮導送至PRIME編輯。

 規模化的挑戰與價值 

內部組裝是一個傳統的實驗室過程，研究人員幾十年來一直依靠它來拼接客製化的DNA序列。然而，當研究需要大量片段時，這個過程就會變得繁瑣而昂貴。這個現實意味著，對大多數實驗室而言，創建包含數千個至數百萬個片段的文庫是不切實際的，甚至是不可能的。

Twist多重基因片段文庫減少了片段組裝的需求，提供了近乎無限規模的長片段DNA，可以減輕這種痛苦。 Twist的DNA合成平台能夠以工業化生產能力快速合成數千個至數十萬個混合基因片段，這也意味著高通量篩選中包含的基因片段在數量上沒有限制，因此多重基因片段文庫似乎可實現無盡的應用。

 實際意義與未來展望 

Twist多重基因片段文庫的推出代表分子生物學領域向前邁出了重要一步。透過高度精確地直接合成長度達500 bp的混合dsDNA片段，Twist多基因片段化簡化了複雜的工作流程，減少了代價高昂的錯誤。研究人員如今可以專注於其工作的創造性和創新性方面，而不再被技術限制和效率低下所困擾。隨著科學界繼續探索多重基因片段文庫的潛力，這個新工具的應用範圍很可能會繼續擴大，推動進一步的創新和發現。

設計需要內部組裝的複雜實驗充滿了吸引力。同時也是可行的。不過，每增加一個步驟都要付出代價，無論是時間、資源，或是可能發生的錯誤。在這種情況下，做得越多，回報可能越少。 Twist多重基因片段文庫在此協助您以更少的工作獲得更多的回報。

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參考文獻：

1. Herring-Nicholas, Ashley, et al. “Selection of Extended CRISPR RNAs with Enhanced Targeting and Specificity.” Communications Biology, vol. 7, no. 1, 12 Jan. 2024, pp. 1–9, www.nature.com/articles/s42003-024-05776-8, https://doi.org/10.1038/s42003-024-05776-8.

2. Replogle, Joseph M., et al. “Combinatorial Single-Cell CRISPR Screens by Direct Guide RNA Capture and Targeted Sequencing.” Nature Biotechnology, vol. 38, no. 8, 30 Mar. 2020, pp. 954–961, https://doi.org/10.1038/s41587-020-0470-y.

3. Koeppel, Jonas, et al. “Prediction of Prime Editing Insertion Efficiencies Using Sequence Features and DNA Repair Determinants.” Nature Biotechnology, 16 Feb. 2023, pp. 1–11, www.nature.com/articles/s41587-023-01678-y, https://doi.org/10.1038/s41587-023-01678-y.

4. Ren, Xingjie, et al. “High-Throughput PRIME-Editing Screens Identify Functional DNA Variants in the Human Genome.” Molecular Cell, vol. 83, no. 24, 1 Dec. 2023, pp. 4633-4645.e9, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.11.021.