Twist 多重基因片段文庫攜手ADAPT平台，實現T細胞受體與抗體的精準設計

Twist 多重基因片段文庫攜手ADAPT平台，
實現T細胞受體與抗體的精準設計

在人體免疫系統的精密防線中，T細胞受體（TCR）扮演著“哨兵”的角色，通過識別細胞表面肽-MHC複合物（pMHC）——這一細胞內蛋白質組的“窗口”，精準區分“自我”與“非我”，清除病毒感染與癌細胞。然而，天然TCR受胸腺選擇限制，對腫瘤抗原的親和力往往不足，而傳統方法改造TCR又面臨pMHC界面複雜、肽段多變且MHC保守易脫靶的挑戰。 2025年11月，由諾貝爾獎得主David Baker教授領銜的華盛頓大學、史丹佛大學及弗雷德·哈欽森癌症中心聯合團隊在預印本平台發表了一項突破性研究，題為「Targeting peptide MHC complexes with designed TCR and antibodies」。他們開發了名為ADAPT（Antigen-receptor Design Against Peptide-MHC Targets）的結構深度學習框架，結合Twist Bioscience的多重基因片段文庫（Multiplexed Gene Fragments, MGF）合成、酵母菌展示及冷凍電子顯微鏡驗證，首次實現了對多種pMHC靶點模擬的TCR及TCR抗體的原子級精度設計，為癌症免疫治療開闢了新路徑。

一、研究背景：pMHC標靶設計的核心挑戰

pMHC複合物由MHC分子與一段8-10個胺基酸的胜肽段組成，是T細胞辨識的天然標靶。然而，其設計面臨三大困難：

三大難點

1. 胜肽段多變：每個pMHC的胜肽段序列不同，是辨識特異性的核心；

2. MHC保守：MHC分子高度保守，容易導致設計的分子脫靶，辨識錯誤的pMHC；

3. 結合模式複雜：TCR透過6個CDR環與pMHC形成複雜的界面，其中CDR3環負責辨識胜肽段，CDR1/2環則與MHC接觸。

儘管已有多種運算方法嘗試優化TCR，但大多侷限於現有binder的改造，真正從頭設計、表位可控的TCR仍屬空白。因此，開發一種能從頭設計CDR環介導的pMHC辨識分子，成為領域內的核心挑戰。

二、技術創新：ADAPT框架的突破性設計

研究團隊開發了ADAPT設計框架，其核心創新在於將微調的AlphaFold2構象取樣與ProteinMPNN序列設計相結合，並透過遺傳演算法進行多輪優化：

天然CDR3庫初始化：從包含1,688,863條天然人類配對CDR3序列的文庫中隨機採樣，確保初始序列的胺基酸組成（如 Glycine甘氨酸佔比12%）、長度分佈（12-18殘基）與天然數據一致，避免人工設計序列的疏水性偏差，確保CDR3環的「可開發性」。

多模板多樣性導入：使用多個TCR/抗體框架模板（來自PDB和SAbDab資料庫），決定CDR1/2環及框架區的序列與結構。

四步單輪設計：

• 初始對接：微調AF2對pMHC-TCR複合物進行建模，透過4個「通用對接模板」引導TCR樣結合模式；
• CDR序列設計：ProteinMPNN對6個CDR環進行序列設計（溫度參數0.1，每個骨架產生3個序列）；
• 再對接：AF2依新序列調整結合姿態，提供品質評分；
• 模型評估：微調RF2再次預測結構，與設計模型比對CDR3 RMSD。

遺傳演算法優化：將排名前100-500的設計作為初始池，透過多進程並行優化－每輪隨機突變2個界面位置、重新設計序列、再對接，並將優化後的模型放回池中（每譜系（lineage）限10個，防止單一譜系壟斷），實現設計空間的深度探索。

透過此流程，ADAPT能夠產生結構精確、抗原決定位特異性、CDR序列70-80% 不同於模板的全新TCR及抗體。

三、實驗驗證：從計算到功能的完整閉環

為驗證設計效果，團隊建構了完整的實驗篩選與驗證流程：

文庫合成並克隆：針對TCR設計，採用兩種策略

• 小規模克隆篩選（30-60條序列/靶點）- A01-EVD、A02-LLW、A02-GLM、A02-TLM
• 大規模文庫篩選（1000-5000條設計/標靶）- A02-ALY、B44-SEI

結合能力篩選：將設計序列導入TCR-null Jurkat T細胞，以流式細胞儀檢測pMHC多聚體染色，評估與9種pMHC標靶的結合能力（包括腫瘤抗原、病毒肽、新抗原）。

T細胞活化功能驗證：將表達設計TCR的轉基因T細胞與抗原呈現細胞共培養，透過GFP報告基因檢測T細胞活化情況，評估功能特異性。

抗體設計拓展：將TCR模板替換為抗體可變區模板，設計TCR模擬抗體，同樣透過酵母菌展示或哺乳動物展示篩選。

結構驗證：對篩選出的陽性設計進行冷凍電子顯微鏡結構解析，驗證其結合姿態與設計模型的一致性。

四、實驗結果：原子級精度的設計與功能驗證

TCR設計成功：針對9種pMHC標靶中的6種獲得成功結合的設計（成功率從0.3%到20.8%不等）。其中4種來自小規模克隆篩選，2種來自大規模文庫篩選（A02-ALY和B44-SEI）。結合模式主成分分析顯示，設計的TCR廣泛分佈於天然TCR結合模式的構形空間。

抗體設計突破：針對3種pMHC標靶均獲得成功結合的設計，成功率介於5.21%至8.33% 之間。單臂親和力範圍從5 nM到700 nM，多數在幾十nM等級。設計的抗體呈現「正向對接」與「反向對接」兩種模式，且均落入天然TCR的結合模式空間內。

冷凍電子顯微鏡驗證設計精度：

• vAB-30與A01-EVD pMHC複合物：整體Cα RMSD 0.7 Å，CDR環Cα RMSD 0.6 Å，胜肽段辨識主要由重鏈CDR2介導（Arg54與Tyr9主鏈氧形成氫鍵）

• vAB-66與A02-TLM pMHC複合物：整體Cα RMSD 0.6 Å，CDR環Cα RMSD 1.2 Å，胜肽段辨識由重鏈CDR1驅動（Asp33與Ser4形成氫鍵）

​

• T細胞活化功能驗證：設計的TCR在標靶胜肽存在下能夠活化T細胞，活化程度與結合強度呈正相關（Pearson's r = 0.87）。針對TdT來源的A02-ALY胜肽段，多個設計表現出良好的特異性，能夠區分單點突變體。

• 雙特異性T細胞銜接器應用：將A02-ALY特異性抗體建構成BiTE，兩個設計（vAB-246和vAB-250）在目標胜肽存在下能夠誘導T細胞激活，突變敏感性模式與設計模型中抗體-胜肽段接觸程度相關。

五、總結與展望

這項研究首次實現了從頭設計、結構精確、抗原決定位可控的TCR及TCR模擬抗體，標誌著計算免疫分子設計邁入新階段。其核心突破在於：

• ADAPT框架成功將微調AF2構象取樣與ProteinMPNN序列設計結合，透過遺傳演算法實現設計空間的深度探索；
• 天然CDR3庫初始化確保了CDR環的“可開發性”，避免了從頭生成的序列過於“非天然”；
• 組合組裝策略有效應對pMHC介面的複雜性，為TCR及抗體設計提供了通用解決方案；
• 冷凍電子顯微鏡與功能驗證的閉環，原子級精度（0.6-1.2 Å RMSD）與T細胞活化功能的雙重確認，證明了設計的可執行性與準確性。

雖然目前設計的特異性仍有提升空間（部分設計在無目標胜肽時出現非特異性活化），但研究指出，透過優化CDR1/2環的胺基酸偏好（目前富集疏水性胺基酸）和強化胜肽段接觸，可進一步提升特異性。未來，隨著模型的持續優化和更大規模實驗數據的回饋，計算設計的TCR有望應用於CAR-T、BiTE等免疫治療形式，精準靶向傳統方法難以觸及的腫瘤新抗原。

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圖1.500bp 雙重gDNA 變異體多重基因片段文庫的片段豐度分佈圖-比對到雙重gDNA 變異體的定序片段數量（x 軸）。 500 bp 雙重gRNA 變異體的多重基因片段文庫顯示完整的片段佔比，具有最少的缺失。

圖2. 450bp 三重gDNA 變異體多重基因片段文庫的片段豐度分佈圖- 比對到三重gDNA 變異體的定序片段數量（x 軸）。 450 bp 的三重gRNA 變異體庫也顯示完整的片段佔比。

圖3. 500 bp 長度的擴增基因片段文庫不同GC 含量下的片段分佈圖，在17.6% - 77.6% 的大範圍GC 含量中顯示出極小的偏差。 X 軸是具有不同GC 含量的14 組序列類別。 Y 軸是定序片段計數。

參考文獻：

Targeting peptide–MHC complexes with designed T cell receptors and antibodies

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