〔技術賞析〕 流式細胞技術與表觀遺傳學的結合
When Epigenetics met Flow 當表觀遺傳學遇上流式細胞技術
自西元20世紀中之後,以DNA、RNA、至蛋白質為中心的教條思維已日漸過時。RNA修飾和轉譯調控機制的發現,揭示了蛋白質的產生和調控應更為複雜。表觀遺傳學(Epigenetics),即研究不涉及DNA Base改變的遺傳因素是基因調控機制的一大主題。
已知的表觀遺傳機制包括:DNA甲基化(Methylation)和組蛋白(Histone)修飾,這些修飾調控了轉錄機制的可及性,此機制影響廣泛,研究範圍涉及癌症、神經科學、發育學等領域。
將表觀遺傳學用於研究免疫學已知是相當困難的。標準的研究方法,如:ChIP與Western Blot提供了總體表現量的資訊,但免疫學的邁進,須由瞭解造血系統中複雜的細胞類型與圖譜;因此能夠分析單顆細胞的流式細胞技術便順理成章地被視為了解造血系統的寶貴資源,而研究那些與細胞標記物結合的表觀遺傳標記物,實驗前需要仔細考慮和計畫。
Experimental Considerations on Flow Cytometry with Epigenetic Marks 實驗前的考量點
相對於細胞表面標記,首先要考慮的是使用強信號的共軛物來克服表觀遺傳標記的低豐度。 藻紅蛋白(PE)因其螢光信號強度而廣受歡迎,Thingium-169則推薦用於後續有質譜分析的需求。
另一個問題是:標定細胞表面的抗體與用於破膜構造的介面活性劑之間的相容性;例如:甲醇可能會破壞表位 (epitope),因此在實驗之前,需要針對抗體進行相容性確效,建議使用條碼標記 (Barcoding)來防止訊號重疊。最後,利用泛組蛋白(Pan-Histone)抗體偵測組蛋白總含量做為樣本量基準,進行正確定量。
Validation of Epigenetic Reagents 工具的實驗前驗證
利用流式細胞技術研究表觀遺傳學的另一個挑戰是:找到特異性佳、適合該方法學的抗體。
驗證抗體的最佳方法是利用藥理學或遺傳學產生陽性和陰性對照。另外表觀遺傳標記的表現豐度有時可由特定刺激(例如:DNA損傷)引發,亦是一種驗證方法。
Applying This Method to Immunology Studies 免疫學上的實際研究成果
流式細胞技術應用於表觀遺傳學已經產生許多有趣的發現。Cheung et al. (PMID:29706550) 發表於期刊Cell的成果中使用了此技術來研究衰老。
在這篇研究<單細胞表觀遺傳學–質譜法揭示的染色質修飾圖譜>之前,還不清楚衰老如何影響造血系統,尤其是不同種類的免疫細胞於表觀遺傳學上的特徵。
他們搭配質譜技術分析了20多種免疫細胞的組蛋白變異和修飾,他們發現年輕族群在細胞層面與個體層面做比較,都具有相似的表觀遺傳特徵;然而在衰老過程,此兩個層面的異質性都會增加。
人類雙胞胎樣本的結果也類似,這表明變異性受環境因素所引發,另外也應證免疫細胞類型可以通過表觀遺傳學特徵來預測。此篇研究展現了流式細胞儀與表觀遺傳學相結合的力量。
如何應用流式細胞儀找到表觀遺傳學的下一個重大發現呢?
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References
Cheung P, Vallania F, Dvorak M, Chang SE, Schaffert S, Donato M, Rao AM, Mao R, Utz PJ, Khatri P, Kuo AJ. Single-cell epigenetics - Chromatin modification atlas unveiled by mass cytometry. Clin Immunol. 2018 Nov;196:40-48. doi: 10.1016/j.clim.2018.06.009. Epub 2018 Jun 28. PMID: 29960011; PMCID: PMC6422338.
Cheung P, Vallania F, Warsinske HC, Donato M, Schaffert S, Chang SE, Dvorak M, Dekker CL, Davis MM, Utz PJ, Khatri P, Kuo AJ. Single-Cell Chromatin Modification Profiling Reveals Increased Epigenetic Variations with Aging. Cell. 2018 May 31;173(6):1385-1397.e14. doi: 10.1016/j.cell.2018.03.079. Epub 2018 Apr 26. PMID: 29706550; PMCID: PMC5984186.
文章轉自Proteintech