奈米螢光二抗- 高解析度成像的次世代二級奈米抗體

產品DM｜Nano-Secondaries: The next level of secondary antibodies

在上一篇我們介紹了ChromoTek 免疫沉澱(IP)的好幫手GFP-Trap ，今天的ChromoTek系列文章，小編要帶大家迎接二級抗體新世代，讓你實驗擁有奈米級的精準！以 Nanobodies（奈米抗體）開發的二抗系列，能夠準確地與一抗之保守區域結合，高度專一辨認特定的抗體亞型(Subclass)，且親合力卓越！加上體積小的特點，用於染色可使訊號集中，更能呈現絕佳成像解析度！針對常見的一抗物種：兔子與小鼠已有完整的產品線，並與Alexa flour偶聯，是螢光染色(IF)的首選！

生物學研究和醫學診斷常離不開抗體。例如，當研究人員通過螢光顯微術研究細胞內某個蛋白質時，他們通常選用針對該蛋白的抗體特異性標記。在「一抗」結合目標蛋白以後，就需要使用攜帶螢光染料的「二抗」去結合「一抗」，從而使目標蛋白在顯微鏡下可見。

(圖一)

造就高成像解析度的秘密就在於奈米抗體的超小體積，這首先要從源自羊駝類動物的重鏈抗體開始說起，不同於常規IgG抗體，羊駝的重鏈抗體缺少CH1結構域，沒有輕鏈，分離自重鏈抗體的抗原結合結構域，即稱為V_HHs 或Nanobody（奈米抗體），大小僅僅2nm，分子量小至15kDa。我們將此一系列針對兔子、小鼠IgG的特異性奈米抗體與Thermo Alexa Fluor染料偶聯，即成就了用於高解析度成像的次世代二級奈米抗體：Nano-Secondaries。

羊駝奈米二級抗體優勢:

快速染色—免疫螢光染色 (IF) 一步到位
更高免疫螢光(immunofluorescence)解析度
不與其他物種、甚至IgG 亞型產生交叉反應

具體來說他有什麼優點呢? 讓我們用下面幾個data來為您展示。

應用:
Immunofluorescence
Super-resolution microscopy
Western blotting
Flow cytometry

快速染色—免疫螢光染色 (IF) 一步到位:

奈米二抗是透過細菌或非動物表達系統生產而來，二抗序列、結合位點以及結構均為已知，因此具有精準的單一抗原結合位點，且親和力極高。而與之相反的傳統單株或多株二級抗體則是利用傳統雜交瘤(hybridoma) 技術生產而來或直接從宿主的血液分離出來。

(圖二)

奈米二抗也因其序列、結合位點以及結構均為已知，才能保證二抗與一抗準確的結合。且可與一抗同時加入預先進行反應，節省實驗時間和省去洗滌步驟。下圖三可以看到上面兩張圖為 One-step 進行一抗(anti-B Actin & anti- Lamin B1)+ Alpaca anti-rabbit IgG V_HH Alexa Fluor^®647 2抗進行預混後染色。而下面兩張圖則為依序與1抗結合 wash 後緊接著加入 Alpaca anti-rabbit IgG V_HH Alexa Fluor^®647 二抗後進行染色，所得到結果同樣完美，但One-step組已經省了至少一小時以上的時間了。

(圖三)

此時你會問除了預混減少實驗時間，還有甚麼特殊之處嗎？答案是有的！

我們經常在多重染色時會需要將一抗的物種避開，這樣的經驗一定很為實驗者帶來困擾：我就是沒辦法錯開物種啊 !

如果能事先預混抗體，再一層一層地進行染色那該多好，ChromoTek 的次世代二級奈米抗體辦到了！請見圖四。

(圖四：3 mouse 1st Abs of different subclasses: staining w/o crosstalk)

Multiplexed immunostaining of HeLa cells with 3 subclass-specific alpaca anti-mouse Nano-Secondaries.

Grey: Mouse IgG1 anti-Vimentin + alpaca anti-mouse IgG1 VHH Alexa Fluor® 647.

Green: Mouse IgG2b anti-Lamin + alpaca anti-mouse IgG2b VHH Alexa Fluor® 488.

Red: Mouse IgG3 anti-MOT + alpaca anti-mouse IgG3 VHH Alexa Fluor® 568.

Scale bar, 10 µm. Images were recorded at the Core Facility Bioimaging at the Biomedical Center, LMU Munich.

Nano-Secondaries適合多重螢光染色的特點亦可應用於西方墨點法實驗（WB），如圖五所示可以在一張WB膜上同時分析多個目標，無需反覆Stripping與重新進行抗體反應。

(圖五)

更高免疫螢光 (immunofluorescence) 解析度

奈米二抗 (Nano-Secondaries) 因大小僅15kDa，相較於傳統IgG二抗150 kDa，大小差了10倍。減少抗原表位和訊號標記物之間的距離 (圖六)，是高解析率顯微鏡的理想探針，例如: STED (STimulated Emission Depletion (縮寫STED))、STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy , 隨機光學重建顯微鏡系統) 等系統。

這個概念有點像4K電視與傳統電視，奈米二抗因為體積小，因此單位面積的螢光分子較多較密，自然讓它的解析度優於類似傳統電視的傳統二抗。

(圖六)

小尺寸奈米二抗也能實現更好的組織穿透力，圖七為果蠅幼蟲的腦Lamin的染色圖 (紅色)，可以看出圖片左邊的部分(anti-Lamin Ab +Nano-Secondary) 其染色較右邊的傳統二抗部分 (anti-Lamin Ab + IgG 2ndAb) 均勻，這則是受惠於奈米二抗具更佳的組織穿透力原因。

(圖七)

STED 介紹:

傳統的螢光顯微鏡，受限於阿貝理論的繞射障礙 (diffraction limitation) 使解析度始終無法突破<200nm。STimulated Emission Depletion (縮寫STED)顯微鏡技術，為一種不經運算達到超解析效果純光學技術，其精髓在於想辦法將焦點附近的螢光分子抑制不發光(stimulated emission depletion)，使得發螢光的範圍變得極小，而達到超解析的效果。此技術乃利用兩道雷射:一為激發螢光之雷射，一為壓制螢光的雷射；兩者重疊整合成甜甜圈狀，中間部位為螢光放光部位，外圈被壓制的甜甜圈部分的則進行受激放光 (此部位的螢光分子無法發出螢光，由激發態S1受激向下躍至S0且產生了波長和相位與壓制雷射相同光子，這些光與發散螢光因為波長不同，兩者可以輕易分開，見下圖a)，突破了繞射侷限，可產生比共軛焦影像更高的解析度，且解析度可隨depletion laser 之強度調整，理論上 depletion laser強度越強可達到越高的解析度(提升至 50 nm 以下)，在實際上機時可針對不同樣本特性而調整最適參數。

(節自臺大顯微影像核心)

STORM 介紹:

Stochastic Optical Reconstruction Microscopy(STORM)隨機光學重建顯微鏡系統，是美國哈佛大學所研發出的光學解析技術，將其應用於超高解析顯微鏡中，突破一般光學極限，水平軸的解析度達20nm，垂直軸的解析度達50nm，XYZ解析力提升十倍，讓光學顯微鏡觀察範圍推向分子層級，開啟科學研究的新視野。

不會與其他物種以及IgG 亞型產生交叉反應

高度物種和亞型特異性:

Nano-Secondaries的專一性可辨認同物種之特定抗體亞型 (Subclass)，且不會與其他常用物種的IgG發生交叉反應(圖八)。其具備高專一性與低背景值，更適用於多重染色。傳統二抗儘管會預先以小鼠血清進行處理，但依然與小鼠IgG具有交叉反應。

(圖八)

下圖九是由3支subclass-specific alpaca anti-mouse奈米二抗所做成的多重免疫染色。灰色：Mouse IgG1 anti-Vimentin + alpaca anti-mouse IgG1 VHH Alexa Fluor® 647。綠色：Mouse IgG2b anti-Lamin + alpaca anti-mouse IgG2b VHH Alexa Fluor® 488。紅色：Mouse IgG3 anti-MOT + alpaca anti-mouse IgG3 VHH Alexa Fluor® 568。比例尺，10 µm。圖像在慕尼黑LMU生物醫學中心的核心設施成像記錄。

因羊駝的奈米二抗具卓越專一性，更適用於多重螢光染色。

(圖九：Multiplexed immunostaining of HeLa cells with 3 subclass-specific alpaca anti-mouse Nano-Secondaries. Grey: Mouse IgG1 anti-Vimentin + alpaca anti-mouse IgG1 VHH Alexa Fluor® 647. Green: Mouse IgG2b anti-Lamin + alpaca anti-mouse IgG2b VHH Alexa Fluor® 488. Red: Mouse IgG3 anti-MOT + alpaca anti-mouse IgG3 VHH Alexa Fluor® 568. Scale bar, 10 µm. Images were recorded at the Core Facility Bioimaging at the Biomedical Center, LMU Munich.)

以上就是奈米二抗的優勢，以上如果有不清楚的歡迎隨時與我們聯繫~

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