新品｜Proteintech 染還是不染？ 了解流式細胞儀使用的不同活性染劑

TO DYE OR NOT TO DYE? 染還是不染？

                        -了解流式細胞儀使用的不同活性染劑

進行流式細胞相關實驗分析時，將凋亡細胞排除之於取得可靠、準確的結果至關重要。本文將提供此類用途的全面產品概述，剖析如何針對實驗挑選最適合的試劑，讓您像007一般，精準挑出干擾分析的凋亡細胞。

在進行流式細胞相關實驗分析時，必須排除樣品中的凋亡細胞，以取得可靠、準確的實驗數據。凋亡細胞可能干擾分析的原因來自：

i）與抗體的非特異性結合

ii）具有比活細胞具有更強的自體螢光

iii）細胞因去氧核糖核酸的釋放而結塊，以上都可能影響數據異動，尤其是在觀察低表達力抗原時，或可能降低細胞分選 (cell sorting) 的效率。

此時可以使用試劑來排除凋亡細胞，目前市面上已有多種試劑可用於標記凋亡細胞，原理則各有不同，伴隨著各自的優缺。本篇希望引領讀者如何選用標定凋亡細胞的試劑，找出最適合自己的實驗目的的產品。

DNA結合染劑 (DNA binding dyes):

在細胞凋亡期間，細胞膜和核膜逐漸分解並變得可滲透，因此，碘化鈾（PI）、7-AAD和DAPI這樣的染劑可以進入細胞並與DNA結合。使用這類染劑的方式相對簡單，通常僅需要在正式分析之前將染劑與細胞樣本進行的短時間的反應。需要注意的是，樣本中的細胞可能持續地凋亡，因此需要確保每個樣品於分析之前，在一致的時間內添加染劑，以確保比較的準確性。DNA結合染劑的缺點亦在於它們利用凋亡細胞的膜滲透性，因此它們無法區分經固定過後的活細胞和凋亡細胞。

以下表格整理了目前常見的 DNA 結合染劑：

可固定的細胞染劑 ( Fixable viability dyes ) :

如上所述，DNA結合染劑只能區分未固定樣本中的凋亡細胞。但仍有許多方法可以識別已固定樣本中的凋亡細胞。這些稱為細胞染劑，原理是與細胞的蛋白質胺基結合，而由於凋亡細胞中的細胞膜受損，染劑可以進入細胞內，與更多的蛋白質結合（圖1），因此凋亡細胞的螢光的強度增高，大約高於活細胞50倍，區分出凋亡與活細胞。細胞染劑，也因此恰如其份地被命名為殭屍染劑™Zombie Dyes™（Biolegend），Ghost Dyes™ 幽靈染劑™（Tonbo Biosciences）等有趣的名稱，另也因易用性、應用性、色彩多變化、搭配彈性，而受到市場的歡迎。

Proteintech近期也推出了一系列細胞染劑：幻影染劑 (Phantom Dyes)，具有7種螢光波長組合可供選擇（見下文）。幻影染劑與細胞蛋白共價結合，因此樣本在以甲醛和酒精固定後依然保持結合。當然幻影染劑也可用於未固定的活細胞，與不同螢光完美搭配組合，也可作為胺基結合反應材料的控制對照組。相關的詳細使用流程，請參閱PMID 20578108。

(圖1) Schematic of the mechanism of DNA binding dyes and Phantom Dyes (fixable viability dyes), demonstrating how they differentiate live and dead cells. 

Proteintech has the following viability dyes: Phantom Dyes:

PD00001             Phantom Dye Red 710 Viability Dye

PD00002             Phantom Dye Red 780 Viability Dye

PD00003             Phantom Dye UV 450 Viability Dye

PD00004             Phantom Dye Violet 450 Viability Dye

PD00005             Phantom Dye Violet 510 Viability Dye

PD00006             Phantom Dye Violet 540 Viability Dye

PD00007             Phantom Dye Blue 516 Viability Dye

細胞健康檢測 (Cell health assays ) :

細胞健康檢測試劑可作為細胞染劑的替代方案，這類產品是利用細胞活性染劑和DNA結合染劑的組合來確定樣本中活細胞和凋亡細胞的比例，通常用於螢光活細胞成像以及流式細胞分析。

Calcein AM就是一種常見的細胞活性染劑，屬於非螢光的細胞滲透染劑，與DNA結合染劑不同，這種分子可以進入活細胞。一旦進入細胞，它通過細胞內酯酶 (esterases) 進行乙氧甲基酯 (acetoxymethyl ester) 水解，進而產生綠色螢光（excitation/emission：495/520nm）。相反地，凋亡細胞的酯酶活性較低，因此沒有螢光。而與不同光譜的DNA 結合染劑一同使用，如：PI（excitation/emission：488/617 nm）或 EthD-I（excitation/emission：528/617 nm）可以測量凋亡細胞與活細胞的比例，能夠在一次檢測中評估可行性和毒性（圖 2）。需要注意的是，這些檢測無法用於經過固定的細胞樣本，因為染劑在無法與固定後的細胞的任何分子結合，因此在染色應儘快進行分析。

Proteintech has a Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live & Dead Cells (Calcein AM, PI Method, Cat# PF00007) and (Calcein AM, EthD-I Method, Cat# PF00008).

(圖2)  Results for the Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Live & Dead Cells (Calcein AM, PI) Cat. number PF00007. Left: In flow cytometry, live cells have positive signal for Calcein AM (FITC/green detection), and dead cells can be visualized as positive for PI (PE-A/red detection). Right: Fluorescence microscopy of Jurkat cells stained with Calcein AM staining shows live cells in green, and PI staining shows dead cells in red.

用流式細胞技術檢測細胞凋亡 ( Detecting apoptosis with Flow Cytometry ) :

細胞凋亡是一個高度調節的細胞機制與過程，對發育和維持生理衡定至關重要。監管不力可導致癌症和阿茲海默症等重大疾病。更多資訊與相關產品可在我們官方部落格上的細胞凋亡專區找到。

流式細胞分析則是研究細胞凋亡的利器之一，因此已有許多相對應的試劑套組和方法學，其中最受歡迎的是Annexin V 和 TUNEL標記法。

Annexin V會與細胞凋亡的早期標誌物：細胞外磷脂蛋白（PS）結合。活細胞的細胞膜的內側會含有PS，然而，在細胞凋亡的早期階段，PS被翻轉到細胞膜的外側；隨著PS暴露在細胞外空間，Annexin V即可結合到PS，若是Annexin V帶有螢光，則早期凋亡的細胞就會被螢光標定，因而區分活細胞和凋亡細胞。 Proteintech的 CoraLite®488-Annexin V和PI凋亡檢測套件（PF00005）即是利用螢光結合Annexin V與PI（圖3）同步分析早期、晚期的凋亡細胞

(圖3)  Schematic showing how Proteintech’s CoraLite®488-Annexin V and PI apoptosis detection kit labels early and late apoptotic cells. Catalogue number PF00005.   

另一種受歡迎的細胞凋亡的檢測法是TUNEL標定。細胞凋亡的另一個主要現象是細胞染色體DNA斷裂、片斷化。這個現象具有法則且規律性，DNA片段是以180-200個鹼基對的倍數的不同長度，利用電泳檢測可見條帶呈現階梯狀。TUNEL標定法及利用終端去氧核糖核酸轉移酶 （TdT） 來催化螢光標記的 dUTP 進入片斷化 DNA 的 3'-OH 端，因此可用螢光顯微鏡直接觀察這些被標記的dUTP-DNA，或通過流式細胞分析進行量化。Proteintech的CoraLite®488和CoraLite®594 TUNEL凋亡檢測套件（PF00006和PF00009）提供分析凋亡細胞一個靈敏、高效的選擇，幫助有效地協助從實驗中排除DNA斷裂、正在步步走向凋亡或壞死的細胞。