High Throughput Antibody Production
高通量抗體生產
讓 Twist 加快您的抗體篩選
在抗體開發流程中，研究人員在從生物淘選(biopanning)過渡到抗體表徵(Antibody characterization)時經常會遭遇瓶頸。噬菌體展示和單 B 細胞測序(single B-cell sequencing) 等技術具有高通量的特性，可以識別出成百上千種用於開發的潛在高親和力抗體。要進一步研究這些抗體，需要以全長抗體的形式表達，這一過程通常是低通量的，會耗費大量資源，是進展過程中的一大障礙。
Twist 高通量抗體生產充分利用 Twist 在自動化 DNA 合成和抗體生產方面的專業知識，同時生產數千種不同的抗體用於篩選和研發，從而打破了這一瓶頸。Twist 可高通量生產 15 µg 至 2000 µg 的抗體，品質優良價格實惠，足以確定需要進一步研究的候選抗體。Twist 採用 HEK-293 瞬時表達系統(transient expression system)，產量穩定、可重複(reproducible)、可擴展(scalable)。由於表達量因抗體序列而異，因此 Twist 使用並報告對照序列的結果，確保轉染和蛋白質生產正常運轉。
HT IgG特點：
1. High throughput (高通量)
．同時產生數千個抗體基因
．靈活的規模，從數十個到數千個抗體
．快速的周轉時間(Turnaround time)
2. Customizable (可定製)
．抗體序列完全可定製
．使用 Twist 的載體或您自己選擇載體
．提供 VHH、scFv-Fc 和 IgG 亞型
3. One-stop-shop for precision (一站式精準服務)
．我們可處理 DNA 合成、克隆、表達和純化
．NGS 序列完美的基因，確保生產高品質抗體
．穩定的專案間(project-to-project)一致性表達
下單流程
點擊查看 ➜ 快速入門指南：Twist 高通量抗體生產
製作流程
簡而言之，Twist 可將重、輕或單鏈可變序列合成並克隆到含有 Fc 的載體中。然後將成對的重鍊和輕鍊或單鏈基因轉染到 HEK293 細胞中 4 天。收穫含有分泌抗體的上清液，並使用蛋白質 A/G 進行純化。分別使用 A280 和 digital CE-SDS 檢查純化抗體的濃度、大小和純度信息。
這個流程需要多長時間？
從序列提交到交付，1mL 和 8mL 抗體訂單的預計交付時間分別為 20-25 個工作日和 22-35 個工作日。
聯絡資訊
E-mail : specialist@abrealbiotech.com
Line ID : @abreal
讓 Twist 加快您的抗體篩選
在抗體產生之後，純化抗體並測定產率。在產生的 518 個抗體中，有 482 種通過了大小和純度品質控制測試——409 種抗體的產量超過 100 ug。
產量穩定
LabChip 通過對樣本進行變性來分析每個純化樣品，以獲得大小和純度數據。運行十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳 (CE-SDS)，根據梯度指標，獲得大小數據，從而確定近似分子量 (kDa) 以及重鍊和輕鏈的純度百分比。 7 kD 處的峰是染料顯色的起始位置。
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可選擇載體 (點擊查看載體檔案)
| Human IgG | VHH |
| pTwist CMV BG WPRE Neo(6842 bp) | pTwist CMV BG WPRE Neo(6842 bp) |
| pTwist CMV hIgG1(7777 bp) | pTwist CMV hIgG1-Fc(7495 bp) |
| pTwist CMV hIgG2(7765 bp) | pTwist CMV hIgG2-Fc(7468 bp) |
| pTwist CMV hIgG4 S228P(7768 bp) | |
| pTwist CMV hIgK(7108 bp) | |
| pTwist CMV hIgL2(7105 bp) |
※列表上都沒有您想要的抗體嗎？沒關係~我們還有提供載體建置(Custom Vector Onboarding)服務！
1. 一管/盤您訂購的抗體
．規格：在 1 mL 或 8 mL 培養物中產生的抗體
．型式：純化蛋白或上清液的型式提供
．提供IgG 的所有主要亞型：IgG1、IgG2、IgG4、Kappa 和Lambda 輕鏈，以及VHH-Fc（IgG1 和IgG2）
．產量：從15 μg 至2,000 μg 不等
．表達系統：使用HEK-293 細胞瞬時表達系統
2. QC 報告
．利用毛細管電泳十二烷基硫酸鈉 (CE-SDS) 測定法進行 A280 定量、大小 (kDa) 和純度百分比分析
3. 加購服務
．Carterra SPR Affinity Assessment
．UNCLE Stability Analysis
．SEC, % Monomer
常見問題
Q1: Twist 是否提供製備好的DNA以及已純化的抗體或上清液抗體？
A1：對於用於抗體生產的合成克隆基因，Twist 提供 clonal gene glycerol stocks。在抗體生產過程中，DNA 因轉染而消耗；但是，glycerol stocks 保存 DNA 並可與生產的抗體一同交付。請參閱從 glycerol stocks 中製備新鮮 DNA 的方案。
Q2: Leader (signal peptide) sequence 有什麼作用？我們在 pTwist 載體中使用了什麼 leader sequence？
A2：Leader or secretory signal sequence 在轉譯過程的早期充當細胞機制結合的肽信號(peptide signal)。這有助於將轉譯複合物(translation complex) 正確定位到內質網，在內質網中抗體鏈(antibody chains) 可以進入分泌途徑以進行蛋白質組裝和細胞分泌。Leader sequence在蛋白質組裝過程中會被切割，因此不會是最終蛋白質的一部份。 Twist 在 pTwist 載體上使用了以下的 leader sequences，這些序列已通過我們的 pTwist 載體進行了測試和驗證：
VH：MKHLWFFLLLVAAPRWVLS
VL：MVLQTQVFISLLLWISGAYG
Q3: Kozak 序列的作用是什麼？pTwist 載體中的 Kozak 序列是什麼？
A3：Kozak 序列將起始前複合體 (Pre-initiation complex, PIC) 和核醣體引導到轉譯起始位點（起始密碼子），並介導核醣體組裝，確保對正確的蛋白質序列進行轉譯 (translate)。
Kozak 序列通常被認為是GCCGCCACCATGG，其中 ATG 是起始密碼子。 Twist 使用起始密碼子 ATG 上游的縮寫版本 GCCACC。
Q4: 若交付型式為media，應如何純化抗體？
A4：您可以使用protein A或 protein G 固相進行純化，兩者可與抗體的 FC 區域結合，具體取決於 IgG 的種類和同種型。或者，您可以使用固定化抗原（全長或短肽抗原）來純化抗體。該方法將取決於抗體的下游應用及特異性。
Q5：生產這些抗體用到的是什麼細胞株？
A5：HEK（人類胚胎腎臟）293 細胞（Expi-293）
Q6：我是否可以用客製化的 Fc 區域（如 IgG3 Fc、突變的 IgG 1 Fc）或小鼠等其他物種來製備抗體？
A6：當客戶想要使用自己的 Fc 區域序列（IgG3、小鼠 IgG 或修飾的Fc）或需要表達其他類型的 Fc 融合抗體時，可以選擇使用 pTwist CMV BG WPRE Neo 表達載體。
請記得在編碼序列的末端放上一個終止密碼子。
Q7：為什麼我們的 IgG constructs 中缺少 C-terminal lysine residues？
A7：研究表明，一旦 IgG 進入循環(circulation)，重鏈的 C-terminal lysine residues（存在於所有 IgG 同種型上）就會被切割掉。研究還表明，Lysine一旦被切割掉就不會對相關功能產生影響，而且它的存在實際上會抑制抗體充分發揮細胞毒性的潛力：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4622059/
Q8：為什麼我們的 VHH-Fc 融合載體(fusion vectors) 中的第 10 個正電子(positon) cystein 會突變為 serine？
A8：這種 full IgG 中的 cystein 與 VHH-Fc 融合構建體中不存在的 LC 恆定區形成雙硫鍵。
Q9：如何上傳我的抗體序列？
A9：請確保序列格式如下所示，以便上傳可變區域：
- 去除 signal leader peptide（使用 pTwist 載體 + signal leader peptide）
- 可變區域不應以任何 CH1 起始序列結束
- 如果您的 ORF 與您的插入位點一致，序列可以分為三個
交付型式
Q1: Buffer exchange有哪些緩衝液選項？
A1：我們使用市售的 PBS
- PBS 7.4 Cat# 21-031-CM Corning
- PBS 6.0 Cat# P1760 Teknova
Q2: 如何檢測抗體的品質？
A2：Twist 在還原條件下檢測每種抗體產品的產量 (µg)、純度 (%) 和大小 (kDa)。每個抗體將通過 LabChip (CE-SDS) 進行檢測，以測定單個重鏈和輕鏈的純度和大小。產量根據 A280 讀數進行定量。上清液樣本使用滴度測定法(titer determination method) 進行定量。在最終文件中，除了純度百分比、重鏈和輕鏈大小外，還會報告每個純化抗體的體積、產量和濃度值。上清液記錄文件中將提供抗體滴度表達水平，包含低、中或高三個表達水平。
Q3: Twist 所提供的 elution 體積是多少? 1mL和8mL 的預期產量是多少?
A3：1 mL = ~220 uL volume, 15-300 ug
8 mL = ~550 uL volume, 15-3000 ug
Q4: 有哪些交付型式可選?
A4：96-deep well plates - custom plate maps available
1.4 mL micronic tube racks
2 mL tubes
10 mL tubes (for 8 mL supernatant only)
序列設計的資源和指導
- AbYsis 為一種或多種抗體提供了綜合、全面、帶註釋的序列評估。 AbYsis 提供了全面的抗體序列區域劃分，以快速確定可變區的起始和結束位點。此外，還以列表的形式提供了對 leader 序列、FWK 序列和 CDR 序列以及末尾序列或恆定區序列的劃分。
- 利用生物資訊學程序(bioinformatic programs) 可將 abYsis 提供的註釋應用於您的序列，有助於可視化和分離可變區。下面是導入到 Geneious Prime 軟體平台且應用了 abYsis 註釋的序列範例。
- 另外一個可提供 leader 序列、可變區和恆定區全面劃分的選項是 ANARCI。分析所得結果會以紅色突出顯示確切的可變區序列，接下來您可將此上傳到我們電子商務網站上的抗體應用程序。 ANARCI 還提供了有關輕鏈結構域類型和序列種類的詳細信息。
- 請記住，可變區序列絕不能以甲硫胺酸 (M) 開頭。如果您將上傳以胺基酸 M 或核苷酸 ATG 開頭的序列，並且計劃使用 pTwist 載體，請聯繫我們的人員尋求幫助。
- 考慮到雙硫鍵和其他特徵之間的差異，將可變結構域從一個物種重組到另一個物種可能會比較複雜。默認情況下，Twist eCommerce平台不會更正這些問題。通常需要您來考慮和檢查這些與重組相關的複雜問題。如果您需要幫助，請聯繫我們的團隊。
下單流程
點擊查看 ➜ 快速入門指南：Twist 高通量抗體生產
製作流程
簡而言之，Twist 可將重、輕或單鏈可變序列合成並克隆到含有 Fc 的載體中。然後將成對的重鍊和輕鍊或單鏈基因轉染到 HEK293 細胞中 4 天。收穫含有分泌抗體的上清液，並使用蛋白質 A/G 進行純化。分別使用 A280 和 digital CE-SDS 檢查純化抗體的濃度、大小和純度信息。
這個流程需要多長時間？
從序列提交到交付，1mL 和 8mL 抗體訂單的預計交付時間分別為 20-25 個工作日和 22-35 個工作日。
聯絡資訊
E-mail : specialist@abrealbiotech.com
Line ID : @abreal
讓 Twist 加快您的抗體篩選
在抗體產生之後，純化抗體並測定產率。在產生的 518 個抗體中，有 482 種通過了大小和純度品質控制測試——409 種抗體的產量超過 100 ug。
產量穩定
LabChip 通過對樣本進行變性來分析每個純化樣品，以獲得大小和純度數據。運行十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳 (CE-SDS)，根據梯度指標，獲得大小數據，從而確定近似分子量 (kDa) 以及重鍊和輕鏈的純度百分比。 7 kD 處的峰是染料顯色的起始位置。
可選擇載體 (點擊查看載體檔案)
| Human IgG | VHH |
| pTwist CMV BG WPRE Neo(6842 bp) | pTwist CMV BG WPRE Neo(6842 bp) |
| pTwist CMV hIgG1(7777 bp) | pTwist CMV hIgG1-Fc(7495 bp) |
| pTwist CMV hIgG2(7765 bp) | pTwist CMV hIgG2-Fc(7468 bp) |
| pTwist CMV hIgG4 S228P(7768 bp) | |
| pTwist CMV hIgK(7108 bp) | |
| pTwist CMV hIgL2(7105 bp) |
※列表上都沒有您想要的抗體嗎？沒關係~我們還有提供載體建置(Custom Vector Onboarding)服務！
1. 一管/盤您訂購的抗體
．規格：在 1 mL 或 8 mL 培養物中產生的抗體
．型式：純化蛋白或上清液的型式提供
．提供IgG 的所有主要亞型：IgG1、IgG2、IgG4、Kappa 和Lambda 輕鏈，以及VHH-Fc（IgG1 和IgG2）
．產量：從15 μg 至2,000 μg 不等
．表達系統：使用HEK-293 細胞瞬時表達系統
2. QC 報告
．利用毛細管電泳十二烷基硫酸鈉 (CE-SDS) 測定法進行 A280 定量、大小 (kDa) 和純度百分比分析
3. 加購服務
．Carterra SPR Affinity Assessment
．UNCLE Stability Analysis
．SEC, % Monomer
常見問題
Q1: Twist 是否提供製備好的DNA以及已純化的抗體或上清液抗體？
A1：對於用於抗體生產的合成克隆基因，Twist 提供 clonal gene glycerol stocks。在抗體生產過程中，DNA 因轉染而消耗；但是，glycerol stocks 保存 DNA 並可與生產的抗體一同交付。請參閱從 glycerol stocks 中製備新鮮 DNA 的方案。
Q2: Leader (signal peptide) sequence 有什麼作用？我們在 pTwist 載體中使用了什麼 leader sequence？
A2：Leader or secretory signal sequence 在轉譯過程的早期充當細胞機制結合的肽信號(peptide signal)。這有助於將轉譯複合物(translation complex) 正確定位到內質網，在內質網中抗體鏈(antibody chains) 可以進入分泌途徑以進行蛋白質組裝和細胞分泌。Leader sequence在蛋白質組裝過程中會被切割，因此不會是最終蛋白質的一部份。 Twist 在 pTwist 載體上使用了以下的 leader sequences，這些序列已通過我們的 pTwist 載體進行了測試和驗證：
VH：MKHLWFFLLLVAAPRWVLS
VL：MVLQTQVFISLLLWISGAYG
Q3: Kozak 序列的作用是什麼？pTwist 載體中的 Kozak 序列是什麼？
A3：Kozak 序列將起始前複合體 (Pre-initiation complex, PIC) 和核醣體引導到轉譯起始位點（起始密碼子），並介導核醣體組裝，確保對正確的蛋白質序列進行轉譯 (translate)。
Kozak 序列通常被認為是GCCGCCACCATGG，其中 ATG 是起始密碼子。 Twist 使用起始密碼子 ATG 上游的縮寫版本 GCCACC。
Q4: 若交付型式為media，應如何純化抗體？
A4：您可以使用protein A或 protein G 固相進行純化，兩者可與抗體的 FC 區域結合，具體取決於 IgG 的種類和同種型。或者，您可以使用固定化抗原（全長或短肽抗原）來純化抗體。該方法將取決於抗體的下游應用及特異性。
Q5：生產這些抗體用到的是什麼細胞株？
A5：HEK（人類胚胎腎臟）293 細胞（Expi-293）
Q6：我是否可以用客製化的 Fc 區域（如 IgG3 Fc、突變的 IgG 1 Fc）或小鼠等其他物種來製備抗體？
A6：當客戶想要使用自己的 Fc 區域序列（IgG3、小鼠 IgG 或修飾的Fc）或需要表達其他類型的 Fc 融合抗體時，可以選擇使用 pTwist CMV BG WPRE Neo 表達載體。
請記得在編碼序列的末端放上一個終止密碼子。
Q7：為什麼我們的 IgG constructs 中缺少 C-terminal lysine residues？
A7：研究表明，一旦 IgG 進入循環(circulation)，重鏈的 C-terminal lysine residues（存在於所有 IgG 同種型上）就會被切割掉。研究還表明，Lysine一旦被切割掉就不會對相關功能產生影響，而且它的存在實際上會抑制抗體充分發揮細胞毒性的潛力：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4622059/
Q8：為什麼我們的 VHH-Fc 融合載體(fusion vectors) 中的第 10 個正電子(positon) cystein 會突變為 serine？
A8：這種 full IgG 中的 cystein 與 VHH-Fc 融合構建體中不存在的 LC 恆定區形成雙硫鍵。
Q9：如何上傳我的抗體序列？
A9：請確保序列格式如下所示，以便上傳可變區域：
- 去除 signal leader peptide（使用 pTwist 載體 + signal leader peptide）
- 可變區域不應以任何 CH1 起始序列結束
- 如果您的 ORF 與您的插入位點一致，序列可以分為三個
交付型式
Q1: Buffer exchange有哪些緩衝液選項？
A1：我們使用市售的 PBS
- PBS 7.4 Cat# 21-031-CM Corning
- PBS 6.0 Cat# P1760 Teknova
Q2: 如何檢測抗體的品質？
A2：Twist 在還原條件下檢測每種抗體產品的產量 (µg)、純度 (%) 和大小 (kDa)。每個抗體將通過 LabChip (CE-SDS) 進行檢測，以測定單個重鏈和輕鏈的純度和大小。產量根據 A280 讀數進行定量。上清液樣本使用滴度測定法(titer determination method) 進行定量。在最終文件中，除了純度百分比、重鏈和輕鏈大小外，還會報告每個純化抗體的體積、產量和濃度值。上清液記錄文件中將提供抗體滴度表達水平，包含低、中或高三個表達水平。
Q3: Twist 所提供的 elution 體積是多少? 1mL和8mL 的預期產量是多少?
A3：1 mL = ~220 uL volume, 15-300 ug
8 mL = ~550 uL volume, 15-3000 ug
Q4: 有哪些交付型式可選?
A4：96-deep well plates - custom plate maps available
1.4 mL micronic tube racks
2 mL tubes
10 mL tubes (for 8 mL supernatant only)
序列設計的資源和指導
- AbYsis 為一種或多種抗體提供了綜合、全面、帶註釋的序列評估。 AbYsis 提供了全面的抗體序列區域劃分，以快速確定可變區的起始和結束位點。此外，還以列表的形式提供了對 leader 序列、FWK 序列和 CDR 序列以及末尾序列或恆定區序列的劃分。
- 利用生物資訊學程序(bioinformatic programs) 可將 abYsis 提供的註釋應用於您的序列，有助於可視化和分離可變區。下面是導入到 Geneious Prime 軟體平台且應用了 abYsis 註釋的序列範例。
- 另外一個可提供 leader 序列、可變區和恆定區全面劃分的選項是 ANARCI。分析所得結果會以紅色突出顯示確切的可變區序列，接下來您可將此上傳到我們電子商務網站上的抗體應用程序。 ANARCI 還提供了有關輕鏈結構域類型和序列種類的詳細信息。
- 請記住，可變區序列絕不能以甲硫胺酸 (M) 開頭。如果您將上傳以胺基酸 M 或核苷酸 ATG 開頭的序列，並且計劃使用 pTwist 載體，請聯繫我們的人員尋求幫助。
- 考慮到雙硫鍵和其他特徵之間的差異，將可變結構域從一個物種重組到另一個物種可能會比較複雜。默認情況下，Twist eCommerce平台不會更正這些問題。通常需要您來考慮和檢查這些與重組相關的複雜問題。如果您需要幫助，請聯繫我們的團隊。